參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)為模板、引物、耐熱DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸和鎂離子，其中關(guān)鍵步驟是**佳引物的設(shè)計(jì)。

1. 模板核酸

模板(靶基因或樣品DNA)核酸的量與純化程度PCR標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。一般**檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。DNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解RNA。

2. 引物

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈作引物。每條引物鏈的濃度為0.1~1μmol或10-100pmol，以反應(yīng)所需要的**低引物量的濃度為好。

3. DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶基因全長2496個(gè)堿基，75~80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷酸，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性和良好的熱穩(wěn)定性，溫度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性。目前，有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。

4. 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。在PCR反應(yīng)中，PCR標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系dNTP應(yīng)為50-200μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。

5. 鎂離子濃度

Mg2+能與dNTP結(jié)合，Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為20μmol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜，Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增：濃度過低，會(huì)降低taqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。